Méthodes de congélation de l’échantillon
La cryoconservation est une méthode de conservation permise par le froid. Son but est de figer toutes réactions biologiques et biochimiques susceptibles de modifier la structure ou la composition d’un échantillon (réaction enzymatique etc…). Le principal problème est que cette baisse de température s’accompagne d’un changement d’état de l’eau qui devient solide et forme des cristaux. Or les cellules contiennent beaucoup d’eau et baignent dans un milieu aqueux, les cristaux formés vont endommager les membranes et entrainer une mortalité cellulaire à la décongélation. L’efficacité de la cryoconservation dépend donc de la température de congélation, de la vitesse de congélation, des agents protecteurs ajoutés et bien sûr de la qualité de l’échantillon !
Plus le froid est intense et plus l’organisation dans l’espace des molécules d’eau et des constituants de la cellule sont affectés. La quasi absence de mouvements et d’activité moléculaire lors d’une cryoconservation en azote liquide à -196°C offre aux échantillons un environnement plus stable qu’en congélateur à -80°C. Toutefois, le choix de la température dépend également des exigences du matériel biologique conservé et de ses objectifs de réutilisation une fois décongelé.
L’efficacité de la cryoconservation dépend des paramètres de température de congélation et des agents protecteurs ajoutés. En effet, les cellules sont vivantes et la chute de température peut entrainer de nombreux dommages : choc thermique, déshydratation, lésions des organelles, cristallisation et dénaturation des protéines qui provoque à son tour l’accumulation de composés toxiques.
Bien que ces problèmes de cristallisation et de dénaturation de protéines puissent être contrés grâce à l’ajout de cryoprotecteurs, il semblerait que ces derniers présentent tout de même une certaine toxicité pour la cellule, d’où la nécessité de bien choisir sa concentration.
La congélation lente
La congélation lente représente la descente progressive de température. Elle possède un risque de formation de cristaux élevé et nécessite une concentration en cryoprotecteurs moins importante que la méthode de congélation rapide. Le temps de contact avec ceux-ci est toutefois plus long.
Les échantillons sont mis dans un système dit fermé ce qui empêche l’interaction de l’azote liquide avec les ressources. Cette méthode se divise en trois phases : la phase de refroidissement qui permet une descente de 1 à 3°C/min, la phase d’induction de la cristallisation ou «seeding» et la phase de descente en température contrôlée où la descente en température est de 0.1 à 0.3°C/min. L’échantillon est ensuite stocké en azote liquide à -196°C jusqu’à son utilisation.
La congélation rapide ou vitrification
La vitrification ou congélation rapide est caractérisée par une chute extrêmement rapide de la température. La vitesse de descente de la température diffère selon le type de système utilisé. L’utilisation d’un système ouvert où l’azote est en contact avec l’échantillon a une vitesse de descente de -20000°C/min, tandis que l’utilisation d’un système fermé a une vitesse de descente de 2500°C/min.
Cette méthode de congélation ne présente pas ou peu de risques quant à la formation de cristaux mais un problème de dénaturation des protéines est possible. Contrairement à la congélation lente, la congélation rapide nécessite l’utilisation d’une concentration en cryoprotecteurs très élevée mais le contact avec les cellules en phase liquide se fait sur un temps plus court.
Exemple : Technique de congélation du sperme équin
Une fois l’échantillon dilué et conditionné en paillettes:
- La température du sperme est équilibrée à 4°C pendant 1h15
- La semence est conditionnée en paillette de 0,5 ml
- Les paillettes sont refroidies en congélateur électronique (vapeurs d’azote) pour atteindre -140°C
Les paillettes sont ensuite transférées en azote liquide à -196°C