Préparation de l’échantillon

Dans le cas de la semence, après comptage au spectrophotomètre, description de la couleur et éventuellement évaluation de la motilité massale, le sperme est filtré pour extraire la fraction gel (qui correspond à la sécrétion filamenteuse des glandes annexes) et les impuretés. Pour évaluer la semence avec un CASA, un échantillon est collecté et dilué au 1:20 ^ème dans une solution saline à 37°C et passé au CASA. Après évaluation, la semence est diluée avec un premier dilueur avant centrifugation à température ambiante pour éliminer le plasma séminal. Le culot obtenu, riche en spermatozoïdes, est de nouveau dilué avec un dilueur adapté pour la réfrigération ou la congélation. Ce dilueur est en général composé d’un milieu salin contenant du glycérol (cryoprotecteur), avec ou sans jaune d’œuf (apport de lipides, lipoprotéines). On peut ajouter des anti-oxydants qui peuvent améliorer la survie, la motilité et la fertilité après congélation. La composition du dilueur dépend de l’espèce concernée. Les spermatozoïdes humains, bovins et canins supportent des concentrations en glycérol entre 6 et 8% du volume total. Par contre chez d’autres espèces comme le cheval, la concentration en glycérol ne doit pas excéder 3,5% du volume total.

Dilueurs

Les dilueurs de semences sont des solutions qui permettent d’ajuster la concentration en spermatozoïdes d’un éjaculat en augmentant son volume. Le dilueur a plusieurs rôles grâce à La présence de divers éléments :

Nutritif : fructose, glucose
Osmotique : NaCl, KCl
Tampon : Tris
Protecteur : antibiotiques

Les dilueurs les plus répandus contiennent du lait de vache demi-écrémé et/ou du jaune d’œuf que les semences soient fraîches ou congelées. Le dilueur doit posséder une osmolarité et un pH du même ordre que ceux du sperme. Il doit contenir des éléments capables de neutraliser les métabolites toxiques émis par les spermatozoïdes au cours de leur conservation, les systèmes tampon du lait remplissent bien ce rôle. Le lait contient des vitamines et autres anti-oxydants qui lui confèrent un rôle protecteur de l’oxydation. Le lait contient aussi des éléments qui protègent les spermatozoïdes contre les dégradations dues au froid (protéines et lactose) et des nutriments capables de subvenir aux besoins énergétiques des spermatozoïdes au cours de la conservation. Leur origine animale représente cependant un risque de transmission de maladies pour le sperme comme pour les animaux. Ainsi, des dilueurs synthétiques ou d’origine végétale sont en cours d’élaboration.

Un cryoprotecteur est une substance qui est ajoutée avant congélation (à -80°C ou à -196°C) afin d’éviter la formation de cristaux à l’intérieur de la cellule et ainsi empêcher les dommages liés à la descente en température. Le cocktail de cryoprotecteurs choisis diffère selon le matériel biologique à cryoconserver, L’espèce du donneur et la méthode de cryoconservation utilisée. Les plus couramment utilisés sont les suivants :

Cryoprotecteurs

Un cryoprotecteur est une substance qui est ajoutée avant congélation afin d’éviter la formation de cristaux à l’intérieur de la cellule et ainsi empêcher les dommages liés à la descente en température. Le cocktail de cryoprotecteurs choisis diffère selon le matériel biologique à cryoconserver (cellules, semence, embryons…), l’espèce du donneur et la méthode de cryoconservation utilisée. Les plus couramment utilisés pour la semence sont les suivants :

Les cryoprotecteurs pénétrants

Les cryoprotecteurs pénétrants sont des solvants qui possèdent un faible poids moléculaire et sont majoritairement dérivés d’alcools. Comme leur nom l’indique, ils entrent à l’intérieur des cellules pour réduire leur déshydratation et l’apparition de cristaux de glace. Ces cryoprotecteurs sont toxiques pour les cellules d’où l’importance de limiter leur temps d’exposition afin de conserver toutes leurs fonctions.

liquide incolore d’odeur légèrement alliacée selon la pureté. Il est très hygroscopique et miscible à l’eau, l’éthanol et l’acétone. Il peut être utilisé comme antigel et comme cryoprotecteur. Le DMSO est très utilisé en cryoconservation. Attention : ce solvant polaire entre très rapidement dans les cellules et peut de ce fait être néfaste s’il a été mis en contact avec des contaminants. Ses propriétés hygroscopiques font qu’il doit être conservé dans des récipients hermétiques ou dans un dessiccateur. La bouteille de DMSO trainant sur une paillasse est à prescrire.

Consulter la fiche INRS du DMSO

Glycérol : liquide incolore, visqueux et inodore. Il est faiblement toxique et est utilisé dans de nombreuses compositions pharmaceutiques. Ce liquide est soluble avec l’eau, facile à manier et a un rôle d’antigel biologique. Ce cryoprotecteur est le plus couramment utilisé dans le processus de préparation des paillettes. Attention : le glycérol peut causer des chocs osmotiques lors de la décongélation.

Ethylène glycol : Liquide hygroscopique (soit capable d’absorber l’humidité de l’air) et incolore. Tandis qu’il est soluble dans l’eau, l’éthanol, et l’acétone, il est insoluble dans l’oxyde de diéthyle, le sulfure de carbone, les hydrocarbures halogénés et les huiles. Ce cryoprotecteur est généralement utilisé comme matière de base des antigels et des liquides de réfrigération.

Consulter la fiche INRS de l’éthylène glycol

Propanediol (ou propylèneglycol) : liquide incolore, légèrement visqueux, peu volatil et pratiquement inodore. Tout comme l’éthylène glycol, ce liquide hygroscopique est soluble dans l’eau, l’éthanol, l’acétone. Il est toutefois insoluble dans les hydrocarbures.

Consulter la fiche INRS de du propanediol

Les cryoprotecteurs non pénétrants

Les cryoprotecteurs non pénétrants se divisent en deux groupes : polymères et sucres. Ces solvants possèdent respectivement de hauts et faibles poids moléculaires. Ils ne rentrent jamais dans les cellules lors de la préparation à la cryoconservation. Leur forte concentration extracellulaire permet la déshydration intracellulaire et évite la cristallisation. De même, ils permettent une protection de la membrane plasmique des cellules à cryoconserver en interagissant avec celle-ci.

Dextran : polymère ramifié de monomères de glucose. Ce sucre est naturellement produit par certains organismes.

Lactose : sucre naturellement présent dans les produits laitiers. Il est composé de deux monomères glucidiques que sont le glucose et le galactose. Ce composé est de couleur blanche et sa solubilité dans l’eau est moindre que celle du sucrose et du glucose.

Polyéthylène glycol : polymère fabriqué à partir de monomères d’éthylène glycol (dérivé d’alcool). C’est un liquide visqueux incolore, il est soluble dans l’eau, l’alcool et l’acétone.

Polyvinylpyrrolidone (polyvidone ou povidone) : polymère issu de la polymérisation de la N-vinylpyrrolidone. Il est soluble dans l’eau, l’acide acétique, l’éthanol, le glycérol.

Saccharose ou sucrose : sucre composé de deux monomères, un monomère de glucose et un monomère de fructose. Ce n’est pas un cryoprotecteur hygroscope mais permet de protéger la cellule de la cryoconservation en évacuant l’eau intracellulaire. Ce phénomène empêche la formation de cristaux de glace.